Vlačilci in potegi: Kako molekularni motor razprši beljakovine | 2020

Vsebina:

Anonim

Tako dr. Aaron Lucius, profesor na Univerzi v Alabami na oddelku za kemijo v Birminghamu, preučuje bakterijsko beljakovino ClpB E. coli, kot izhodišče za razširjene raziskave na medicinsko pomembnih modelih v prihodnjih letih. Vprašanje je, kako ClpB dejansko opravlja svoje delo za razpletanje beljakovin?

"Ne vemo, kako se beljakovine zapletajo, toda če lahko preučimo, kako se beljakovine razčlenijo, ima lahko klinični pomen," je dejal Lucius.

ClpB je eden od širokega asortimana podobnih molekularnih strojev, ki jih najdemo v vseh živih celicah, znanih kot heksamerni AAA + encimi. Imajo šest podenot, ki tvorijo šesterokotnik z luknjo v sredini in gorijo ATP za energijo. Medtem ko so stroji vsi podobni, se vrste dela, ki jih opravljajo, zelo razlikujejo - primeri vključujejo odcepitev DNK, pomoč pri prebavljanju beljakovin, razpletanje beljakovin, rezanje mikrotubul, pomoč pri oblikovanju rastlinskih celic in gibanje membranske fuzije.

ClpB je tesno povezan z encimom ClpA E. coli. Za razliko od ClpB - ki ima nalogo razpletanja beljakovine, ki je izgubila svojo pravilno obliko - ClpA pomaga prebaviti nepotrebne beljakovine v majhne peptidne fragmente. Beljakovine so verige aminokislin, ki so med seboj povezane kot kroglice na vrvici in nato zložene v natančno obliko. ClpA lahko zgrabi en konec beljakovine, ki je bila označena za recikliranje, in jo potegne skozi osrednjo luknjo ClpA, kot sidrna veriga, ki se je vlekla skozi luknjo ladje. Hidroliza ATP vpliva na procesno vlečenje in razvejana beljakovinska veriga je potisnjena v priloženi encim ClpP, ki reže verigo "kot molekularni papirni drobilnik", je dejal Lucius.

Prejšnja laboratorijska skupina je pridobila dokaze, da je ClpB tudi procesna translokaza, kar pomeni, da potegne beljakovinsko verigo skozi to osrednjo luknjo v dolgem nizu stopničastih vlačilcev, vendar so bili prisiljeni uvesti artefakt v encim ClpB poskusi. Lucius in njegovi kolegi UAB raziskovalci zdaj izpodbijajo ta model. Po iskanju načina za testiranje ClpB brez uvedbe artefakta, njihovi eksperimentalni rezultati kažejo, da ClpB encim naredi samo enega ali dva vlačilca na zapleteni beljakovini, nato pa se spusti.

"Naši rezultati podpirajo molekularni mehanizem, kjer ClpB katalizira razdruževanje beljakovin z vlečenjem in spuščanjem izpostavljenih repov ali zank," so zapisali v dokumentu, ki so ga pred kratkim objavili v Biokemična Journa l , podobno kot bi nekdo vlekel za ohlapne pramene zapletene kroglice preje.

Ta predlagana nova paradigma o tem, kako lahko funkcije ClpB veljajo za druge encime, ki se ne razpletajo. "Potreben bo čas, da vidimo, ali je sprejet," je dejal Lucius.

Študija heksamerne funkcije AAA + zahteva zahtevne eksperimentalne pristope. "Ne moremo videti beljakovin; moramo pripraviti pametne načine, da ugotovimo, kaj počnejo," je dejal Lucius.

Njegov laboratorij je leta 2010 odkril tako pametno tehniko, ko je delal s ClpA. Toda, ko ga je študent Tao Li poskušal uporabiti v raziskavah ClpB in pričakoval, da bo našel podobne rezultate procesne translokacije, o kateri je poročala prejšnja skupina, "je opravila tri leta vseh možnih poskusov, da bi ugotovila, ali se translocira in ni našla nobenih dokazov. za prenos, "je dejal Lucius. Tako je laboratorij UAB začel razmišljati o alternativah, kar je privedlo do ugotovitve, da je encim ClpB naredil le en ali dva vlačilca pred sproščanjem substratnega proteina. Preizkusili so tudi ClpB, ki je imel vstavljen artefakt, in ugotovil, da je bilo to, kar se je zdelo, da je bilo preneseno prejšnjim raziskovalcem, le nespecifična razgradnja beljakovin brez translokacije skozi centralno luknjo ClpB.

Eksperimentalni pristop ClpB se veže na substratni protein v prisotnosti analoga ATP, ki spodbuja vezavo, vendar ne more delovati za napajanje encima. Vezani substrat ima fluorescenčno etiketo, ki je pritrjena na svoj oddaljeni konec, vendar pa je fluorescenca zavrta z vezavo na ClpB. Zmes vstavimo v eno brizgo in v drugo brizgo vstavimo visoko koncentracijo ATP in neoznačenega substrata. S pritiskom na sprožilec, bat, ki ga poganja 120-kilogramski dušikov plin, zmeša vsebino obeh brizg skupaj v dveh tisočinkah sekunde in zdaj, v prisotnosti ATP, ClpB stroj lahko gre na delo. Ta tehnika je znana kot fluorescenca ustavljena-tok.

UAB raziskovalci iščejo povečano fluorescenco, ko ClpB sprosti označeni substrat. Če encim vleče označeni substratni protein skozi osrednjo luknjo heksamera, bo časovni zamik, preden se fluorescenca poveča. Ta zaostanek se bo povečal, ko bodo testirani daljši proteinski substrati. Ampak, če ClpB samo vleče enkrat ali dvakrat, nato pa spusti substrat, ne bo nobenega lag. Pogoji so nastavljeni tako, da potem, ko vsak posamezen ClpB heksamer sprosti svoj fluorescentno označen substrat, encim ne bo vezal drugega, ker je presežek neoznačenega substrata. Tako metoda fluorescence stop-flow pokaže le en promet za vsak encimski kompleks.

Ko je bil ta sistem uporabljen s ClpA, je prišlo do zamika, preden se fluorescenca poveča, in ta zaostanek se je povečal s povečano dolžino substratnega proteina. Oba rezultata sta skladna z encimom ClpA, ki ga poganja ATP, in potegne substratni protein skozi njegovo osrednjo luknjo. Z 127 aminokislinskim substratom je ta zaostanek trajal 10 sekund. Ko je bil ta sistem uporabljen s ClpB, ni bilo nobenega zamika in dolžina substrata ni vplivala na to, kako hitro se je fluorescenčni signal povečal. Tako je ClpB hitro sprostil substrat.